Western Blot實驗中濾紙及膜的選擇

Western Blot實驗中濾紙使用的濾紙必須是 WHATMAN 3MM層析濾紙 

zui常用的3MM層析濾紙20x20cm 3030-861 

還有其他型號可選 

3MM層析濾紙27cmx1m 3030-704
3MM層析濾紙27cmx10m 3030-704
3MM層析濾紙27cmx100m 3030-704
3MM層析濾紙19cmx100m 3030-690
3MM層析濾紙23cmx100m 3030-700

1、NC膜、PVDF膜、尼龍膜怎樣鑒別？

解答：尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型；硝酸纖維素（NC）膜是目前應用zui廣的一種固相支持物，價格*；PVDF膜介于二者之間。

就結(jié)合能力而言：尼龍膜結(jié)合DNA和RNA能力可達480－600μg/cm2，可結(jié)合短至10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜結(jié)合DNA和RNA能力可達80－100μg/cm2，對于200bp的核酸片段結(jié)合能力不強；PVDF膜結(jié)合DNA和RNA能力可達125－300μg/cm2。

就溫度適應性而言：尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結(jié)合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合DNA，結(jié)合不牢固；PVDF膜結(jié)合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。

就韌性而言：尼龍膜較強；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；PVDF膜較強。

就重復性而言：尼龍膜可反復用于分子雜交，雜交后探針分子可經(jīng)堿變性被洗脫下來；硝酸纖維素膜不能重復使用；PVDF膜可以重復使用。

2、在做Western Blot時，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。

3、檢測磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一張膜上嗎？

解答：可以。

4、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大分子蛋白的一端（即點樣的一側(cè)）的轉(zhuǎn)膜不是很好？

解答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢，延長轉(zhuǎn)移時間和電流，大分子一端就會好的多，但是小分子的就有可能會變淡。

5、膜一般要如何處理？

解答：一般用甲醇泡泡就可以了。

6、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達到效果。

解答：無要求。

7、跑電泳的時候配的膠總是“縮"是什么原因呢？是有的成分不對嗎？

解答：沒什么問題，就是膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加點水保持濕度就可以了。如果過夜，膠里的水分被蒸發(fā)，采用保鮮膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑，避免找麻煩。脫色液中甲醇的含量太高也會造成膠縮。

8、膜、濾紙、膠大小有何講究？

解答：如果是用的是半干轉(zhuǎn)，順序為：陰極－濾紙－膠－膜－濾紙。濾紙的長寬比膠的長寬小1－2mm，而膜的長寬分別比膠的長寬大1－2mm。禁忌：上下兩層濾紙因為過大而相互接觸，這樣會短路，電流不會通過膠和濾紙。

9、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？

解答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12％SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)36V，3－5hrs就可以了， 可以根據(jù)實驗室的經(jīng)驗調(diào)節(jié)；170kd 用7%SDS－PAGE， 48V 10hrs－16hrs。

10、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？

解答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）(優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》)，因為甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至6％。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓／電流；增加轉(zhuǎn)移時間。

11、如何選擇zui合適的蛋白雜交膜？

解答：蛋白質(zhì)印跡雜交是分子生物學實驗中極為常用的一門技術(shù)。選擇質(zhì)量上層、合乎要求、方便適用的雜交膜是決定這項實驗成敗的重要環(huán)節(jié)。根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我們要量體裁衣，從雜交膜的材質(zhì)、孔徑和規(guī)格上都要做出合理的選擇。

硝酸纖維素膜：硝酸纖維素膜是蛋白印跡實驗的標準固相支持物。在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負電荷的蛋白質(zhì)會與硝酸纖維素膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，雖然這其中的機制還不是十分清楚，但由于硝酸纖維素膜的這個特性，而且易于封閉非特異性結(jié)合，從而得到了廣泛的應用。在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，要選擇不同孔徑的硝酸纖維素膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。但是膜孔徑如果小于0.1μm，蛋白的轉(zhuǎn)移就很難進行了。因此，我們通常用0.45μm和0.2μm兩種規(guī)格的硝酸纖維素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用0.45μm的膜就會發(fā)生“Blowthroμgh"的現(xiàn)象。從膜的質(zhì)地上來看，zui重要的指標就是單位面積上能夠結(jié)合的蛋白的量。硝酸纖維素膜的結(jié)合能力主要與膜的硝酸纖維素的純度有關(guān)，市場上有些硝酸纖維素膜通常會有大量的醋酸纖維素，因而降低了蛋白的結(jié)合量。S&S公司采用的是100%純度的硝酸纖維素，保證了zui大的蛋白結(jié)合量，可達80-150μg/cm2。由于100%的純度，因而也大大減少了非特異性的結(jié)合，降低雜交背景，無需高嚴謹度的洗脫步驟。其次，膜的強度和韌性也是需要考慮的因素。常規(guī)的硝酸纖維素膜比較脆，漂洗一兩次就會破損，不能反復使用。

PVDF轉(zhuǎn)移膜：PVDF是一種高強度、耐腐蝕的物質(zhì)，通常是用來制造水管的。PVDF膜可以結(jié)合蛋白質(zhì)，而且可以分離小片段的蛋白質(zhì)，zui初是將它用于蛋白質(zhì)的序列測定，因為硝酸纖維素膜在Edman試劑中會降解，所以就尋找了PVDF作為替代品，雖然PVDF膜結(jié)合蛋白的效率沒有硝酸纖維素膜高，但由于它的穩(wěn)定、耐腐蝕使它成為蛋白測序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜與硝酸纖維素膜一樣，可以進行各種染色和化學發(fā)光檢測，也有很廣的適用范圍。這種PVDF膜，靈敏度、分辨率和蛋白親和力在精細工藝下比常規(guī)的膜都要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇進行浸泡飽和1-5秒鐘。

離子交換型轉(zhuǎn)移膜：硝酸纖維素和PVDF膜是靠疏水作用結(jié)合蛋白的，還有一類膜是根據(jù)離子交換的方式結(jié)合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修飾的纖維素制成的DEAE陰離子交換膜同樣可以 作為蛋白質(zhì)印跡的固相支持物。DEAE可以有效的結(jié)合陰離子基團，包括那些高于其等電點的蛋白質(zhì)。在pH10以下，DEAE基團都能帶電荷，在低離子強度的轉(zhuǎn)移液中結(jié)合蛋白分子。其zui適的pH環(huán)境為5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血紅蛋白的研究。這種0.45μm孔徑的DEAE膜，除了可以做Western Blotting外，還可以用于核酸結(jié)合研究。
還有一種離子交換型膜是羧甲基（CM）修飾的纖維素膜，它可以結(jié)合蛋白和多肽分子，以及其他的一些帶正電荷的樣品，zui適結(jié)合pH范圍在4-7。結(jié)合的多肽分子可以從CM膜上洗脫下來，用于氨基酸系列分析或微測序。