實(shí)驗(yàn)室中如何運(yùn)用Whatman 離子交換纖維素

有關(guān)如何使得介質(zhì)獲得很好結(jié)果，Whatman公司已為蛋白質(zhì)、酶和核酸片斷等生物多聚物的有效分離特別開(kāi)發(fā)了一系列Whatman離子交換纖維素。在使用時(shí)只有確實(shí)按注意事項(xiàng)操作才能得到很好結(jié)果。

介質(zhì)種類(lèi)

交換劑的預(yù)處理

1．預(yù)溶脹（51，52和53型）型離子交換劑不用預(yù)先反復(fù)處理就可使用。但必須用緩沖液使充分平衡。預(yù)溶脹的離子交換劑在每次預(yù)處理或再生后使用時(shí)不要用任何方法使它變干。

2．為了得到盡可能好的結(jié)果，對(duì)干的離子交換纖維素（23和32型）預(yù)處理的每一步必須按下面將介紹的那樣進(jìn)行操作。

3．DE51、QA52、SE52和SE53含防腐劑。它會(huì)在平衡和裝柱時(shí)自動(dòng)隨之除去。如果離子交換劑還進(jìn)行平衡，防腐劑可以用蒸餾水或脫離子水洗滌。

一般操作注意點(diǎn)

*離子交換劑可以在室溫下貯存。

*當(dāng)不用時(shí)可以一直密封保存。

*可以用蒸餾水，更好地是用脫離子水。

*為了避免交換劑變細(xì)，不可以激烈搖動(dòng)或攪動(dòng)交換劑懸液。

*為了延長(zhǎng)使用期離子交換劑不可以用濃酸、濃堿或強(qiáng)氧化劑處理。為了再生，滅菌和去熱原介質(zhì)可以用0.5N－2.0N NaOH處理48小時(shí)。

*離子交換劑在沒(méi)有緩沖液或多聚電解質(zhì)又不添加防腐劑情況下不要超過(guò)一星期，陽(yáng)離子交換劑（CM和SE類(lèi)）采用0.1％（W/V）疊氮鈉、0.1%（W/V）2.2二硫雙（氧化吡啶）或0.02％（W/V）乙基汞硫化水楊酸鈉。陰離子交換劑（DE和QA類(lèi)）用0.2％（W/V）烷基—二甲ji－芐ji氯化銨。

*部分 干型離子交換纖維素

預(yù)處理

1．稱(chēng)重的離子交換劑加到15倍容積（W/V）酸或堿液中輕輕攪動(dòng)，進(jìn)行*次處理。

2．微粒產(chǎn)品至少浸留30分鐘，纖維狀產(chǎn)品浸60分鐘。

3．濾出或潷出上清液，用水洗至下列"中間pH"。

4．再用15倍容積的二次處理用酸或堿液浸泡交換劑，放置30分鐘，濾出上清液。

5．重復(fù)上述"4"二次處理，然后用水洗至洗液呈中性。

處理?xiàng)l件

注意：對(duì)預(yù)溶脹的微粒狀產(chǎn)品（51.52和53型）不需進(jìn)行這一步，因此干型產(chǎn)品用在大規(guī)模柱分離更好。

第二部分 預(yù)溶脹型離子交換纖維素和預(yù)處理后的干型離子交換纖維素

交換劑懸液的準(zhǔn)備

一般QA52型和SE52型全離子化交換劑在用低離子濃度緩沖液平衡時(shí)比DE52和CM52型處理時(shí)間更短就可達(dá)平衡。

而且所有介質(zhì)當(dāng)采用的緩沖離子是共有離子時(shí)所需平衡容積zui少，也就是與離子交換劑相一致的緩沖液，例如采用三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（TrisHCl buffers）對(duì)DE或QA型離子交換劑平衡所需時(shí)間和容積都要比用醋酸鹽類(lèi)緩沖液少。

所有情況下實(shí)際采用的起始緩沖液濃度比需要的起始緩沖液濃度高（典型的高10倍），這樣有利于交換劑的預(yù)平衡。下面介紹的是更可取的平衡方法。

離子交換劑裝柱后在進(jìn)樣品前必須用低離子濃度的緩沖液進(jìn)行平衡，通常將2～4倍柱床容積的低濃度緩沖液通過(guò)填充柱就可完成平衡。

推薦的方法

1.在使用之前用緩沖液的濃溶液（0.2－1.0M）輕輕搖動(dòng)攪起離子交換劑2－3分鐘。zui初取干型纖維素時(shí)每克干品約用15～30ml緩沖液，濕離子交換劑約用6ml/g

2.在攪動(dòng)下緩沖液的酸或堿成分使緩沖液/離子交換劑懸液的pH調(diào)到所希望的值。

3．讓?xiě)乙撼两挡A出上清液中的細(xì)小子。

4．再次用緩沖液使離子交換劑松散。干型離子交換劑懸液的總?cè)莘e按30ml/g計(jì)，濕離子交換劑約為6ml/g.

5.離子交換劑和緩沖液的懸液在合適的量筒中沉降，并置于無(wú)灰塵、無(wú)直射陽(yáng)光和不發(fā)熱的地方。沉降時(shí)間可按t=nh式計(jì)算。式中：t=時(shí)間（分）， h=量筒中懸液總高度（公分），n=系數(shù)可取1.3~2.4。

6.注意"濕沉降容積"是離子交換劑在規(guī)定條件下沉降后所占容積。除去上清液中所含細(xì)粒后留在量筒中的zui終容積是"濕沉降容積"加20％。

填裝短柱或長(zhǎng)柱時(shí)懸液可以選用上述密度，但是纖維狀產(chǎn)品的長(zhǎng)柱床的密度需用"濕沉降容積"加50％

變換緩沖液可用方法

1．按上項(xiàng)（1）那樣輕輕攪起離子交換劑到一定容積的緩沖液中。

2．放置10分鐘，傾出或?yàn)V出上清液。

3．重復(fù)處理直到濾液或上清液確實(shí)與緩沖液的PH和電導(dǎo)率一樣為止。變換緩沖液后必須核對(duì)PH等。當(dāng)采用低濃度緩沖液時(shí)本方法會(huì)有所變化，且需要增加處理的時(shí)間。

4．除去細(xì)顆粒和裝柱的準(zhǔn)備工作請(qǐng)按上述（4）（5）和（6）項(xiàng)進(jìn)行。

裝柱

在裝柱時(shí)必須避免離子交換劑和緩沖液懸液的對(duì)流翻動(dòng)。

為此必須使懸液倒入柱中瞬間離子交換劑形成沉降柱床層，操作進(jìn)行得盡可能快，否則懸液中的對(duì)流需很長(zhǎng)時(shí)間才會(huì)停下來(lái)。

1、離子交換用柱應(yīng)垂直置于無(wú)灰塵、無(wú)直射陽(yáng)光和不發(fā)熱等環(huán)境中。

2、假如懸液容積大于柱容積時(shí)應(yīng)接一段延長(zhǎng)管。

3、輕輕攪動(dòng)下將懸液倒入柱中。

4、讓洗脫液從柱中排出。

5、全部懸液加完后裝上或插入柱頂蓋。

6、緩沖液用泵或流動(dòng)法通過(guò)柱，流速控制至少45ml/hr/cm²柱內(nèi)截面積，直到柱床高度恒定。

7、停止緩沖液流進(jìn)或流出柱。

8、取下延長(zhǎng)管（若裝著）并換上柱頂蓋。

平衡

需強(qiáng)調(diào)的是必須正確讀取pH和電導(dǎo)率。

對(duì)真正的平衡而言平衡后的溶液應(yīng)與起始緩沖液一致。必須做倒不僅連續(xù)兩次平衡溶液的讀數(shù)相同，而且要與起始緩沖液相同。不正確的平衡常是產(chǎn)生無(wú)重現(xiàn)性結(jié)果的原因。

起始緩沖液流過(guò)柱直到流出液的電導(dǎo)率和pH地與起始緩沖液相同。此方法適于開(kāi)始時(shí)用低濃度緩沖液的柱分離。

樣品準(zhǔn)備和加樣

樣品溶于起始緩沖液中并調(diào)整溶液的pH。細(xì)胞提取物和硫酸銨沉淀物要用層柱起始緩沖液透析。這一步不注意就有可能得到無(wú)法重現(xiàn)的結(jié)果?；旌衔锿ǔＴ诳刂屏魉傧录拥街?。

洗脫

加樣品后立刻開(kāi)始洗脫或在規(guī)定時(shí)間下開(kāi)始。

通常有三種方法層析分離。有分步洗脫，連續(xù)梯度洗脫和分段梯度洗脫。

分步洗脫

離子交換劑平衡和樣品混合物準(zhǔn)備時(shí)所用緩沖液也可在洗脫時(shí)用，洗脫可以?xún)煞N方式完成：

1．目的物分子是游離狀態(tài)的。所需離子交換劑量要根據(jù)混合物污染程度、結(jié)合力和成分而定。柱床高度在這種方式操作并不重要。

2．目的物分子是結(jié)合狀態(tài)的。層析時(shí)混合物是由相類(lèi)似的成分組成的，為了獲得很好操作應(yīng)選用相對(duì)長(zhǎng)些的柱。可取的是只用了柱總?cè)萘康暮苄∫徊糠郑ㄈ?%）。

應(yīng)避免離子交換劑平衡和柱中層析分離兩者選用不同的緩沖液，除非系統(tǒng)已經(jīng)明確顯示出會(huì)得到錯(cuò)誤的結(jié)果時(shí)才考慮。

梯度洗脫

連續(xù)地或分段地改變緩沖液的組分用于有效分離。緩沖液的組分變化可以是提高一種離子濃度或改變適當(dāng)?shù)膒H，或者兩者都改變。緩沖液本身是達(dá)到分離目的的主要因素，離子交換劑的量需要按離子交換劑對(duì)目的化合物的交換容量而定。萬(wàn)一混合物含層析相近似的組分時(shí)，為了獲得好的分辨力需要增加些柱的長(zhǎng)度。

特殊技術(shù)

滅菌

所有Whatman離子交換介質(zhì)除P11型之外為了滅菌都可以高壓滅菌，是離子交換劑用pH6.5-7.5的非揮發(fā)性緩沖液配成的懸液中進(jìn)行。

建議的滅菌條件是10psi 15分鐘，或15psi10分鐘。另外除P11型之外所有的產(chǎn)品也可以用化學(xué)滅菌法，將介質(zhì)分散在0.5M NaOH中，然后用滅菌水洗滌。所有產(chǎn)品也可用含20~25%體積百分比的乙醇水溶液處理。

脫氣（對(duì)陰離子交換劑）

對(duì)大多數(shù)靈敏的分離，為了獲得重現(xiàn)性好的結(jié)果，DE和QA纖維素交換劑需除去吸附的二氧化碳。假如懸液預(yù)先按上述推薦的方法處理過(guò)后一般就不必進(jìn)行這一步。

1. 將纖維素加到酸性緩沖液中。

2. 調(diào)整pH在4.5。有時(shí)甚至要用更高濃度的酸溶液來(lái)調(diào)節(jié)pH。

3. 在攪拌下抽真空（壓力降至10cmHg以下）直到?jīng)]有更多的氣泡產(chǎn)生，在不產(chǎn)生沸騰之后停止真空。較合適的是在抽濾瓶中帶磁力攪拌器攪拌下進(jìn)行，抽濾瓶與吸氣器相連。

4. 加堿性緩沖液使達(dá)所希望的pH。對(duì)要求更高的分離，所用緩沖液必須用除CO2和水配置以保證無(wú)CO2。

采用含醇緩沖液

對(duì)SE53型介質(zhì)需用含醇緩沖液，平衡時(shí)先用水緩沖液處理，然后再用含醇緩沖液系統(tǒng)完成平衡。

分批法離子交換

1，將一定量的已預(yù)處理并平衡過(guò)無(wú)細(xì)粒的離子交換劑加到原溶液中。

2，按原溶液中所含成分的容量攪動(dòng)一定時(shí)間進(jìn)行吸附分離。

3，用過(guò)濾法或離心法將離子交換劑和緩沖液分開(kāi)。

4，用平衡時(shí)所用緩沖液洗滌離子交換劑。

5，在攪動(dòng)流化床下或離心下解吸，也可以將纖維素裝柱后用上述洗脫技術(shù)進(jìn)行解吸。

有關(guān)Whatman 離子交換纖維素介質(zhì)大規(guī)模分離應(yīng)用請(qǐng)與Whatman 公司。公司聯(lián)絡(luò)地址：SpringfieldMill ,Maidstone,Kent.ME142LE,England.

Whatman 離子交換介質(zhì)的在位清洗方法

在許多運(yùn)作中，Whatman 分離介質(zhì)能多次使用。為保持其再生的水平，建議采用下述在位清洗的方法：

1. 用2柱子容量的0.5M濃度的*溶液清洗，并在室溫下浸泡12小時(shí)；

2. 用2柱子容量的除礦質(zhì)水清洗；

3. 用2柱子容量的四倍濃度的起始緩沖液清洗；

4. 用6柱子容量的起始緩沖液平衡柱子。

上述清洗過(guò)程種可清除吸附在柱內(nèi)的蛋白質(zhì)和類(lèi)脂物，并不會(huì)影響層析的特性或介質(zhì)的穩(wěn)定性。介質(zhì)的消毒亦在此過(guò)程中得以完成。即使對(duì)嚴(yán)重污染的介質(zhì)亦是有效的。

如果上述清洗未能產(chǎn)生效果，可用濃度較高的*溶液（可達(dá)2M NaOH）。在這種情況下，介質(zhì)與*接觸的時(shí)間可以減小。

貯藏方法：

如果介質(zhì)需要貯藏亦個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)間，可采用下述方法以確保產(chǎn)品的特性。

在柱內(nèi)或象散裝泥漿似的貯藏離子交換纖維素，建議用下述抑菌劑，pH范圍為3－11：

基團(tuán) 建議用抑菌劑

DE或QA 0.2％W/V Benzalkonium Chloride

CM或SE 0.1%W/V 疊氮鈉或

0.1%W/V 二硫雙（吡啶－N－氧）或

0.02％W/V 硫柳汞

P11 0.1%W/V 二硫雙（吡啶－N－氧）

證書(shū)：

Whatman 所有型號(hào)的離子交換介質(zhì)都已獲得美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）頒發(fā)的DMF（Drug MasterFile）證書(shū)。如：

DMF11103 快速離子交換介質(zhì)D 

DMF11102 快速離子交換介質(zhì)Q

DMF11101 快速離子交換介質(zhì)S

DMF11100 快速離子交換介質(zhì)C

因此，若需要藥證生產(chǎn)的產(chǎn)品，Whatman 離子交換介質(zhì)能容易地獲準(zhǔn)用于藥物生產(chǎn)業(yè)的層析分離。